2019年（nián）10月1日（rì），5-羟甲基化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病研究领域（yù）取（qǔ）得重（chóng）要进展。2型糖尿病（T2D）的血管并发（fā）症是（shì）导致2型糖尿病致残致（zhì）死的重要病（bìng）因，一（yī）直缺乏一种无创便捷的临（lín）床途径实现血管并发症（zhèng）的发生发展监测，达到早（zǎo）发现、早干预，以提高T2D病人的整体生（shēng）活质量，减少卫生（shēng）经（jīng）济负担（dān）。

该研究（jiū）入组（zǔ）了62例2型糖尿病病人，采（cǎi）用5hmC-Seal技术（shù）对血（xuè）浆（jiāng）cfDNA中表观遗传（chuán）标志物（wù）5hmC的分布情况进（jìn）行（háng）检测，分析（xī）5hmC标志（zhì）物与2型（xíng）糖尿病血管（guǎn）并发症发（fā）生发展的相关性。结果表（biǎo）明5hmC标志物（wù）的（de）变化与T2D合并大血管（guǎn）/微血管事件具有相关（guān）性，主（zhǔ）要涉及一些与（yǔ）血管生物学和糖尿（niào）病（包括胰（yí）岛素耐受和炎症反应）相关的基因（yīn）和信号通路。该研究建（jiàn）立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准确区分有并发症（zhèng）和无并（bìng）发症的2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优（yōu）于传统临床变量例如白蛋白（bái）尿。除此之外（wài），还建立了13个基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测，可以进（jìn）一（yī）步（bù）区分T2D合并单（dān）一并发症和多种并发症[实（shí）验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映（yìng）了（le）T2D病人大（dà）血管（guǎn）/微血（xuè）管并发（fā）症发生（shēng）过程中的表（biǎo）观遗传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技术在监（jiān）测糖尿病血管（guǎn）并发症发生（shēng）和（hé）进展方面具有（yǒu）良好的临床应用前景。

本研（yán）究共纳入62例2型糖尿病病人（rén），包括没有血管并发症的病人12例，有单一血管并（bìng）发症的病人34例（lì）（24例（lì）发生（shēng）大血管事件，10例发生微血（xuè）管事（shì）件），以及有多种血管并发症的病人（rén）16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周（zhōu）血cfDNA中（zhōng）的（de）5hmC序列，进（jìn）行二代测序，通（tōng）过生物信（xìn）息学（xué）分析找（zhǎo）出并发（fā）症（zhèng）组与无并发症（zhèng）组之间有显著5hmC修（xiū）饰差异的基因，单一并发症组（zǔ）和多种（zhǒng）并发症组之间（jiān）有显著5hmC修饰差异的基因（yīn）。随后利（lì）用回归模型对（duì）差异基因进一步筛选、优化（huà），弹性（xìng）网络进一步筛选，计算加权平均分，最（zuì）后得到（dào）一组（zǔ）具有高（gāo）度灵敏（mǐn）度和特（tè）异性的5hmC生物标记（jì）物，并（bìng）进一（yī）步在（zài）实验组中验证，分析其灵（líng）敏度和特异性。并将新建（jiàn）立的5hmC标志物基因组合的检（jiǎn）测性能与传统临床变量进行对比分析。最后对相关基因进行了信号通路分析和（hé）功能探究。

5hmC修饰水平与血管并发症具有（yǒu）相关性（xìng）

利用逻（luó）辑回（huí）归模型对62例有并发症和无并（bìng）发症2型糖尿病病人（rén）的（de）5hmC差（chà）异（yì）水平进行分析发现（xiàn），有并发症2型糖（táng）尿病（bìng）病人的622个差异修饰候选（xuǎn）基因（包（bāo）括上调和下调基（jī）因（yīn））的归一化平均数要明显高于无并发症的病（bìng）人（P<0.001），但是（shì）单一并发症和（hé）多发并发症病人之间没有显（xiǎn）著差异。

之（zhī）后将有（yǒu）单一并发症或多种并发症的50例病（bìng）人用逻辑（jí）回归模型进行了（le）对比，发（fā）现多（duō）种并发（fā）症的病人的153个差异修饰候（hòu）选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均数要低于无（wú）并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志（zhì）物可区分有无并（bìng）发（fā）症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=31）和测试（shì）组（zǔ）（n=31）。利用弹性网络筛选后发现，16基（jī）因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组合检（jiǎn）测可（kě）以用（yòng）于区（qū）分（fèn）有（yǒu）并发症和无并发症的2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权（quán）平均分（fèn）分（fèn）析，发现无并发症病（bìng）人的分数在训练集和测试（shì）集中都明显（xiǎn）低于有（yǒu）并发症的病人（rén）。只（zhī）考虑加权平均分的话，受试者工作特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置（zhì）成0.5时，在测试组中中的（de）灵（líng）敏度为60%，特（tè）异（yì）性为100%。

5hmC标志物可区分病人是单一并发症还（hái）是多种并发症

50例有并发症的2型糖尿病（bìng）病（bìng）人被（bèi）随（suí）机分成训练（liàn）组（n=25）和（hé）测试（shì）组（n=25）。利用弹性网络（luò）筛选后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物（wù）组合可以（yǐ）区分（fèn）2型糖尿病病人（rén）是否发生单一并发症或多种并发症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多种并发症（zhèng）的加权平均分，发现在（zài）训练集和测试集中单一并发症和多种并发症病人的分数都有明显（xiǎn）差（chà）异。值得一提（tí）的是（shì），有肾病并发症和无肾病并发症（zhèng）病人的分（fèn）数也（yě）有明显差异（yì）。利用加权（quán）平（píng）均（jun1）分作（zuò）为判（pàn）断标（biāo）准的受试者工作（zuò）特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值（zhí）设成0.69时，灵敏度为87.5%，特（tè）异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变（biàn）量/危险因（yīn）子的对比

我们评估了不同临床（chuáng）变量/危险因（yīn）子用于监测（cè）血管（guǎn）并（bìng）发（fā）症的灵敏度（dù）和特（tè）异（yì）性（见表1）。

信号通路分析和功能探究

有并发症和无并发症病人的135个差异候选基（jī）因（yīn）的功（gōng）能注释分析表明，这些基因主（zhǔ）要富集在一些经典的信号通路。错误发现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所（suǒ）介导的信号（hào）通路。由IGF1R和IL-10介导的信（xìn）号（hào）通路与（yǔ）胰岛素抵抗（kàng）及炎症（zhèng）反应相关，在（zài）血管生物学（xué）和糖（táng）尿病（bìng）发生发展过（guò）程中发挥重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素（sù）编码基因（yīn）[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛（fàn）素A-52亚基核糖（táng）体蛋（dàn）白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差异（yì）候选基因中, 一些基（jī）因 （如（rú）TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表（biǎo）现出与糖尿病病程相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖（táng）尿（niào）病血管并发症之间可能存在时间依赖性（xìng）的相（xiàng）互作用。基于（yú）纵向时（shí）间队列的大样本研究，将可进一步明确（què）5hmC变（biàn）化和糖尿病持（chí）续（xù）时（shí）间（jiān）之（zhī）间的动态关联（lián）。关于单一并（bìng）发症和多种并发症病人的159个候（hòu）选标志基因的功（gōng）能（néng）注（zhù）释研究发现（xiàn），存在细胞-细胞连（lián）接、胶原蛋（dàn）白形成（chéng）、新（xīn）陈代谢、细胞应激应答信号（hào）通（tōng）路的富集，这（zhè）些信号（hào）通路均与细（xì）胞基（jī）本功能密切（qiē）相（xiàng）关。

血管并发症是三分之（zhī）二糖尿病（bìng）病人（rén）的死（sǐ）亡原因，若能及早有效（xiào）控制（zhì）血（xuè）管并发症的发生，将（jiāng）极大（dà）地改善糖（táng）尿病（bìng）病人的生存质量。该（gāi）研（yán）究（jiū）建（jiàn）立了（le）一种（zhǒng）利用（yòng）cfDNA进行（háng）2型糖尿病血管并发（fā）症监测的无（wú）创便捷方法，较（jiào）目前临床（chuáng）标志物能更准确地监控血管并发症的发生（shēng），从（cóng）而提示临床及早采取应对措施（shī），有效控制病情进展。